Еще за два века до официального открытия в 1765 году галерея Уффици была известна, и ее можно было посещать по предварительным заказам. В путеводителе 1591 года по Флоренции, составленном Франческо Бокки, говорилось, что она «одна из наиболее превосходящих по красоте в мире и полна античных статуй, благородной живописи и драгоценнейших предметов».
Галерея была создана в городе, где когда-то был введен в употребление исчезнувший на века термин «музей» — античные греки этим словом обозначали место, посвященное Музам. Еще в XV веке в саду флорентийской церкви Сан Марко была выставлена коллекция античных скульптур 
Лоренцо Медичи Великолепного «для красоты, для изучения, для удовольствия».
Дело своего великого предка продолжил Козимо I Медичи, решивший построить большой дворец для размещения административных (uffici) и судебных (uffizi) учреждений магистратуры Тосканского герцогства. Для реализации проекта был приглашен мастер Джорджо Вазари, который в 1560 году начал строительство палаццо в форме подковы «на реке и почти в воздухе».
Здание Уффици представляет собой два однотипных крыла,
соединенных крытой аркой — переходом.
Декор здания прост и строг: серый камень (pietra serena) в сочетании с белой штукатуркой, входом служит портик с аркадами.
Дворец Уффици строился как часть единого комплекса, где жила семья герцогов Медичи, правителей Тосканы. Поэтому Вазари через пять лет после начала работ возвел «воздушный» коридор, соединяющий Уффици с палаццо Питти (новой резиденцией Медичи) и идущий поверх моста Понте Веккьо.
Так появилось новшество в мировой урбанистике – коридор Вазари: важнейшие точки города – река, старый мост, административный центр – были объединены поразительным воздушным проходом, использовавшимся тогда исключительно представителями двора.
В 1574 году Вазари умер и заканчивал строительство дворца Бернардо Буонталенти. Так как Вазари использовал железо для прочности строительной конструкции, то его преемнику удалось создать почти сплошную стену из стекла на верхнем этаже. На этом третьем этаже Буонталенти возвел выставочные залы, среди них – так называемую «Трибуну» с куполом и высоко расположенными окнами. Восьмигранный купольный свод инструктирован перламутровыми раковинами по пунцовому лакированному фону.
Естественный свет мягко струится из окон восточного хрусталя на картины, развешанные по стенам, обшитым красным бархатом, на скульптуры и другие ценные предметы.
Само помещение символизирует космос, точнее его элементы: фонарь с розой ветров – воздух, раковины – воду, красные стены – огонь, мраморы и драгоценные камни пола – землю.
В середине XIX века ниши на фасаде Уффици были украшены мраморными статуями (скульпторы Дюпре и Бартолини), изображающими великих людей Флоренции: Козимо Медичи Старшего и его внука Лоренцо Великолепного, художников Джотто, Пизано, Леонардо да Винчи, Микеланджело, мореплавателя Америго Веспуччи.
Уже в наши дни на террасе Уффици над Лоджией Ланци обустроена смотровая площадка.
К концу XVI века здание Уффици начало формироваться как музей. Основой послужила частная коллекция дома Медичи, чей вклад в развитие Флоренции как мирового центра искусства поистине неоценим.
Коллекционирование как особый род деятельности, предназначенной для интеллектуального досуга, зародилось в Италии XV века и затем распространилось по всей Европе. Собрания раритетов и произведений искусства стали рассматриваться как источник высокого духовного наслаждения, а также как обязательный атрибут «просвещенного монарха».
Меценатство стало семейной традицией герцогов Медичи, передававшейся из поколения в поколение. Основные шедевры собрания были либо заказаны членами семьи, либо приобретались ими для Уффици или для Питти.
В 1581 году Франческо I Медичи, страстный коллекционер и настоящий знаток, приказал перенести в Уффици наиболее ценные предметы семейной коллекции из дворцов и вилл, а расположенные на втором этаже административные службы удалить. С этого времени здание Уффици стало музеем, в связи с чем были произведены значительные перестройки. Впервые в истории музейного дела были созданы специальные выставочные помещения.
31 октября 1737 года последняя представительница династии Медичи, Анна Мария, подписала «Семейное соглашение» с Францем Стефаном Лотарингским, правителем Тосканы, о том, что здание Уффици, дворец Питти и все коллекции рода Медичи переходят в собственность городу. Анна Мария поставила определенные условия: памятники, хранящиеся в Уффици, никогда не должны покидать Флоренцию, коллекция должна быть доступной для всех желающих. Таким образом, с 1737 года галерея Уффици приобретает статус публичного музея, раньше, чем Лувр, Британский музей и большинство других.
Галерея Уффици обладает богатейшим в мире собранием итальянской живописи XIII — XVIII веков, где особенно хороши произведения венецианской и флорентинской школ. Прекрасными образцами представлено античное, французское, немецкое, испанское, голландское и фламандское искусство.
Ценнейшие произведения искусств, расположенные в хронологическом порядке, систематизированные по художественным направлениям, школам и мастерам, размещены в 45 залах. Залы расположены вдоль двух основных коридоров, богато украшенных гобеленами фламандских и флорентийских мастеров, а также античными скульптурами и древнеримскими статуями.
Вдоль первого, восточного, коридора с полами из квадратов белого и серого мрамора
и гротесковыми потолками с изображением деяний рода Медичи
расположены залы с первого по двадцать четвертый, так называемый кабинет миниатюр, где находится 400 миниатюр – небольшого размера портреты различных эпох и школ, смонтированные в большие квадраты.
Вдоль третьего, западного, коридора расположены залы с 25 по 45, в которых представлены произведения живописи XVI — XVIII веков.
Короткий второй, южный коридор, соединяющий первый и третий коридоры и застекленный с двух сторон, своими широкими окнами смотрит на реку Арно и внутренний двор галереи Уффици.
Выставочная площадь галереи Уффици составляет 8 000 квадратных метров, на которой размещено 2000 художественных произведений (еще 1800 находятся в запасниках), и посещают ее более 1,5 миллиона человек в год. И каждый из них на вопрос «С чем у вас в первую очередь ассоциируется Флоренция?» не задумываясь, ответит: «Галерея Уффици».
